RNA 干扰技术的原理与应用（上）

马鹏鹏 薛社普 韩代书 ( 中国医学科学院基础医学研究所 , 中国协和医科大学基础医学院细胞生物学系 , 北京 100005)

1.RNAi 是由双链 RNA 所引起的序列特异性基因沉默。
RNAi 首先由 Fire 等发现于秀丽隐杆线虫 (C. elegans) 中 , 他们发现将 dsRNA 注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达 , 并证实这种抑制主要作用于转录之后 , 所以又称 RNAi 为转录后基因沉默 ( postt ranscriptional gene silencing ,PTGS) 。随后人们陆续在果蝇 (Drosophila) 、锥虫 ( Trypanosomes) 、涡虫 ( Planaria) 、斑马鱼 ( Zebrafish) 、拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 、大小鼠和人体内发现了 RNAi 现象 , 遗传学研究表明 RNAi 是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制 , 与真核细胞中许多重要生物学过程密切相通过对 RNAi 现象的遗传学与生物化学研究 , 其作用机制已日渐清晰 ( 见图 1) 。 Zamore 等利用果蝇胚胎提取物建立的体外系统 , 证实 RNAi 是一个依赖 ATP 的过程 , 在此过程中 , dsRNA ( 外源的或体内产生的 ) 首先被降解为具 5'2 单磷酸、长 21 ～ 23bp 的小分子双链 RNA , 这种 RNA 分子称为小干扰 RNA , siRNA 通过碱基互补配对识别具同源序列的 mRNA , 并介导其降解。研究表明在生物体中 siRNA 具相似的结构特征 : 为长约 21 ～ 23bp 的双链 RNA , 具 5' 单磷酸和 3' 羟基末端 , 互补双链的 3' 端均有一个 2 ～ 3nt 的单链突出。在 RNAi 过程中一种称为 Dicer 的核酸酶负责将 dsRNA 转化为 siRNA , 它属于 RNase Ⅲ家族 , 具有两个催化结构域、一个解旋酶 ( helicase) 结构域和一个 PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille ) 结构域 , Dicer 在催化过程中以二聚体的形式出现 , 其催化结构域在 dsRNA 上反平行排列 , 形成四个活性位点 , 但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性 , 这两个位点在相距约 22bp 的距离切断 dsRNA , 各种生物体内 Dicer 结构略有不同 , 致使 siRNA 长度存在微小差别。 siRNA 形成之后 , 与一系列特异性蛋白结合形成 siRNA 诱导干扰复合体 ( siRNA induced interference complex , RISC) , 此复合物通过碱基互补配对识别靶 mRNA 并使其降解 , 从而导致特定基因沉默。在 RISC 中 , 起靶序列识别作用的是 siRNA 的反义链 , Zamore 等发现在 RNAi 过程中 , 首先产生的是 RISC 无活性前体 , 分子量～ 250kD , 当加入 ATP 后可形成 100kD 的活性复合体。由无活性前体向活性酶复合物的转换类似蛋白酶原的激要求结合于其上的 siRNA 双链的解开。在 ATP 存在时 , 依赖于 ATP 的解旋酶解开 siRNA 的双链并将其正义链与靶 mRNA 置换 , mRNA 取代正义链与反义链互补 , 然后由活化的 RISC 在互补区的中间 , 距离 siRNA 反义链 3' 末端约 12bp 处切断靶 mRNA 序列。 RNAi 效应具有两个明显的特征 , 特异性和高效性。干扰的高效性提示在机制中存在信号放大的步骤。 Fire 等早在 1998 年便发现少量的 dsRNA 就能够导致线虫大量的靶 mRNA 降解 , 但单凭少量 dsRNA 被 Dicer 降解为几十个 siRNA 并不能解释这种高效性。许多研究显示 RNAi 过程中有新的 dsRNA 分子的合成 , 当 siRNA 反义链识别并结合靶 mRNA 后 , siRNA 反义链可作为引物 , 以靶 mRNA 为模板在依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶 (RNA2dependent RNA polymerase , RdRP) 催化下合成新的 dsRNA , 然后由 Dicer 切割产生新的 siRNA , 新 siRNA 再去识别新一组 mRNA , 又产生新的 siRNA , 经过若干次合成切割循环 , 沉默信号就会不断放大 ( 图 1) 。正是这种称为靶序列指导的扩增 ( target2directed amplification) 机制赋予了 RNAi 的高效性和持久性。　

2.RNAi 机制相关基因和酶

生命过程中的 RNAi 现象受多种基因和酶的调节。通过对链孢酶 (N. crassa) 、网柱原虫 (Dictoyostelium) 、果蝇、线虫、拟南芥等的研究 , 人们对与 RNAi 相关的基因和酶有了一定的了解。在链孢酶中 , qde21 基因编码的 QDE21 蛋白是 RdRP 的同源物 , qde22 基因编码 Argonaute 家族的一个成员。在网柱原虫中发现了 3 个 RdRP 的同源物 , 其中两个由 rrpA 和 rrpB 基因编码 , 但只有 rrpA 编码的酶参与 RNAi 过程。在线虫中已鉴定出至少有六个基因 ( rde21 ,rde22 , rde23 , rde24 , mut27 , ego21) 与 RNAi 过程相关 , 这些基因突变可导致 RNAi 现象缺失 (RNAi deficient) , 其中 RDE21 蛋白与链孢酶中的 QDE22 以及植物中的 AGO21 同源 , 同属于 Argonaute 家族。 mut27 编码一种具有 3' → 5' 外切核酸酶活性的蛋白 , ego21 基因编码 RdRP 同源物 , 如果发生突变将造成某些胚系 (germline) 基因沉默解除 , 最终导致胚系发育缺陷 , 这也表明 RNAi 机制与发育存在一定关系。另外研究者还发现 smg22 、 smg25 、 smg26 基因与 RNAi 效应的维持相关 , smg22 编码一种依赖于 ATP 的 RNA 解旋酶 , 可能参与 RNAi 过程中 siRNA 双链的解开。在拟南芥中 , sde23 基因编码一个与线虫 SMG22 相似的 RNA 解旋酶 , 参与 PTGS 过程 , 而 sde21 编码蛋白介导转入基因的沉默 , 与 PTGS 无关。除上述基因之外 , 还有一些重要的基因产物也参与 RNAi 过程 , 如线虫中编码 Dicer 酶的 dcr21 基因 , Dicer 在 RNAi 起始阶段负责将长的 dsRNA 切割为 siRNA , 对 RNAi 过程至关重要。虽然目前已经发现了与 RNAi 机制相关的几十个基因 , 但 RNAi 是一个极为复杂的生物学过程 , 一定会有更多参与 RNAi 过程的基因和酶被逐步发现。

3.RNAi 的生物学功能

RNAi 机制依赖于 siRNA 反义链与靶序列之间严格的碱基配对 , 所以具有很强的特异性 , 研究表明 RNAi 机制除了参与转录后对 mRNA 的稳定性调节 ( 即转录后基因沉默 ) 之外 , 还与其他重要的生物学过程有关。

3.1 通过组蛋白甲基化影响染色质结构

最近 , Volpe 等利用裂殖酵母 (S. pombe) , 发现整合入着丝粒区的转基因表达总被抑制 , 他们称此现象为 " 着丝粒沉默 " (cent romeric silencing) , 随后发现着丝粒沉默是由于此区域核小体组蛋白 H3 的 Lys29 甲基化后引起染色质凝集所致 , 并证明与 RNAi 相关的基因突变可使组蛋白 H3 甲基化消失 , 同时使着丝粒沉默现象消除。由此可知 , 至少在裂殖酵母中 , RNAi 机制可通过组蛋白甲基化改变染色质结构造成着丝粒区域基因沉默。与此同时 Bartel 等从裂殖酵母中分离出了一种与着丝粒区序列同源的小 RNA 分子 , 将其命名为异染色质 siRNA , 并推测 " 着丝粒沉默 " 是由 siRNA 造成的序列同源区组蛋白甲基化所致 , 即在着丝粒区域 , DNA 一条链连续表达 , 而另一条链间断表达 , 两条链的转录本互补形成 dsRNA , 然后通过 RNAi 机制形成 siRNA , siRNA 引导甲基转移酶到序列同源的着丝粒区 , 使组蛋白甲基化 , 最终导致染色质结构改变 , 从而调节基因活性。

3.2 通过 DNA 甲基化在转录水平调节基因表达

对 RNAi 相关基因突变体的研究表明 RNAi 机制参与细胞编码基因正常转录的调控 , 生物体内三种基因沉默机制 ---DNA 甲基化、协同抑制和转座子沉默均与 RNAi 有关。 Wessenegger 等 1994 年在植物中发现染色体 DNA 甲基化依赖于 RNA 复制 , 即依赖于双链 RNA 的存在。随后 Wessenegger 与 Pelissier 又证实病毒在细胞内复制所形成的双链 RNA 可使宿主染色体上长约 30bp 的同源序列甲基化 , 并发现只要存在序列同源性 , 双链 RNA 即可使基因发生甲基化。 DNA 甲基化后 , 基因就会失去转录活性 , 不再起始转录 , 导致特定基因沉默。而且这种甲基化状态可以传给子代 , 使该基因在子代中表达仍然受到抑制。协同抑制现象指转入的基因可导致细胞内同源基因沉默 , PalBhadra 等证实在果蝇中协同抑制是由于 Polycomb 复合体结合到内源基因上所致 , Polycomb 由 siRNA 引导并结合到同源序列附近 , 使染色质处于非活性状态 , 抑制其起始转录。另外 Sijen 等发现在矮牵牛 ( Petunia) 中若转入基因产生的 dsRNA 与靶基因的启动子同源则会导致转录水平基因沉默 ( t ranscriptional gene silencing ,TGS) , 若与编码区同源则会导致转录后基因沉默 (PTGS) , 而且还发现 TGS 和 PTGS 过程中都有小分子 RNA 产生 , 并且两个过程均伴随靶序列的 DNA 甲基化 , 最终都可导致基因沉默。

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