琼脂糖凝胶电泳技术

1、琼脂糖凝胶的特点
    

　天然琼脂（ agar ）是一种天然多聚糖，主要由琼脂糖（ agarose ，约占 80% ）及琼脂胶（ agaropectin ）

组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于

这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果

。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：

　1 ）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 　

　2 ）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占 98%~99% ），近似自由电泳，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，

分辨率高，重复性好。

　 3 ）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。

　 4 ）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定，制成干膜可长期保存。
   

　目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术

，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术， 0.1ug 蛋白质就可检出。
    

　　琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如 DNA 鉴定， DNA 限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操

作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。

　 2. DNA 的琼脂糖凝胶电泳

     琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。

1) 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

　A DNA 分子的大小 在凝胶中， DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此

通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当 DNA 分子大小

超过 20kb 时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶

电泳分离 DNA 时，分子大小不宜超过此值。

　B 琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的 DNA 需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

琼脂糖浓度与 DNA 分离范围

　2) 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

     不同构型 DNA 的移动速度次序为：供价闭环 DNA （ covalently closed circular ， cccDNA ） > 直线

　DNA> 开环的双链环状 DNA 。当琼脂糖浓度太高时，环状 DNA （一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为 0

（ Rm=0 ），而同等大小的直线双链 DNA （刚性棒状）则可以长轴方向前进（ Rm>0 ），由此可见，这三种构型的

相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。

　3) 电泳方法

　A 凝胶类型

    用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下 1 -2mm

，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格

的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。

　B 缓冲液系统

     缺少离子时，电流太小， DNA 迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和

DNA 的变性。

　　常用的电泳缓冲液有 EDTA （ pH8.0 ）和 Tris- 乙酸（ TEA ）， Tris- 硼酸（ TBE ）或 Tris- 磷酸（ TPE ）等，浓度

约为 50mmol/L(pH7.5 ― 7.8) 。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。 TAE 缓冲能力较低，后两者有

足够高的缓冲能力，因此更常用。 TBE 浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存 5× 溶液，用时稀释 10 倍

0.5× 工作溶液即能提供足够缓冲能力。

　C 凝胶的制备

     以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。

　D 样品配制与加样

    DNA 样品用适量 Tris-EDTA 缓冲液溶解，缓冲液内含有 0.25% 溴酚蓝或其他指示染料，含有 10%-15% 蔗糖或 5%~10% 甘油

，以增加其比重，使样品集中。 为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生 U 形条带，可改用 2.5%Ficoll （聚蔗糖）代替蔗糖或

甘油。

　 E 电泳

     琼脂糖凝胶分离大分子 DNA 实验条件的研究结果表明，在 低浓度、低电压下，分离效果较好 。在低电压条件下，线性

DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的 DNA 片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压

的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离 DNA 片段的最大分辨率，电场强度不宜高于 5V/cm 。

     电泳系统的温度对于 DNA 在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%

时，为增加凝胶硬度，可在 4℃ 进行电泳。

F 染色和拍照

     常用荧光染料溴乙锭（ EB ）染色，在紫外光下观察 DNA 条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行

有关的数据分析。

　　3. 印迹转移电泳

    生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的 DNA 进行分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作， 1975年

， Southren 创造了将 DNA 区带原位转移到硝酸基纤维素膜（ NC 膜）上，再进行杂交的方法，被称为 Southren 印迹法。随

后， Alwine 等将类似方法用于 RNA 印迹，被戏称为 Northern 印迹， 1979 年 Towbin 等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸

纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为 Western 印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等

制成夹心饼干状，用低电压高电流电泳完成转移。 1982 年 Reinhart 等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到

特定膜上，称 Eastern 印迹。

　 目前国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装置出售，使印迹转移速度快效率高、重复性好，应用更加广泛。聚丙烯酰

胺凝胶也可用于印迹转移电泳，但转移蛋白质时，凝胶中不可含有 SDS 、尿素等变性剂。用于转移电泳的支持膜亦有多种选择，

近些年用尼龙膜较多，因为尼龙膜机械性能好，烘烤不变脆，使用时比硝酸纤维素膜更方便。

     进行印迹转移电泳时，要注意缓冲液的离子强度要低， pH 要远离 pI ，使蛋白质带有较多电荷，一般用稳定性较好的

Tris- 缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间有能有气泡。适当提高电压或电流可以提高转移速度，但亦会增加热效应，故电压

或电流不可过高。

　4. 交变脉冲电场凝胶电泳

     一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于 20kb 的 DNA 。这是因为在琼脂糖凝胶中， DNA 分子的有效直径超过凝胶孔径时，

在电场作用下，迫使 DNA 变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大。如此时改变电场方向，则

DNA 分子必须改变其构象，沿新的泳动方面伸直，而转向时间与 DNA 分子大小关系极为密切。 1983 年 Schwartz 等人根据

DNA 分子弹性弛豫时间（外推为 0 的滞留时间）与 DNA 分子大小有关的特性，设计了脉冲电场梯度凝胶，交替采用两个垂直

方向的不均匀电场，使 DNA 分子在凝胶中不断改变方向，从而使 DNA 按分子大小分开。后来 Carle 等改进了电泳技术，并发

现周期性的反转换电场 (periodic inversion of the electric field) 亦能使大分子 DNA 通过电泳分开。电泳系统是由一水

平式电泳槽和两组独立、彼此垂直的电极组成，一组电极负极为 N ，正极为 S ；另一组负极为 W ，正极为 E 。一块正方形

琼脂糖凝胶板（ 10cm * 10cm 或 20cm * 20cm ）呈 45 度放中央。电场在 N-S 和 W-E 之间交替建立。电场交替改变的时间

长短与欲分离的 DNA 分子大小有关。电泳时， DNA 分子处在连续间隔交替的电场中。首先向 S 极移动，然后改向 E 极。

在每次电场方向改变时， DNA 分子就要有一定的时间松弛，改变形状和迁移方向。只有当 DNA 分子达到一定构型后，才能继

续前时。 DNA 分子净移动方向与加样线垂直，使样品中各组分沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数百万

碱基对的大分子 DNA 。较新式的仪器电极间的角度和脉冲时间均可调，使用更加方便。